支原體qpcr法檢測(cè)過程及方法詳解

一、核心檢測(cè)原理  

以支原體保守基因?yàn)榘袠?biāo)，通過特異性引物與熒光探針結(jié)合，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增與信號(hào)監(jiān)測(cè)的同步進(jìn)行。通過Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）量化樣本中支原體核酸含量，Ct值<30為陽(yáng)性，Ct>40或無擴(kuò)增為陰性。  

二、全流程操作步驟  

樣本采集與預(yù)處理  

類型適配：細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解液等樣本需-20℃/-80℃冷凍保存，運(yùn)輸時(shí)使用干冰/冰袋。  

處理關(guān)鍵：液體樣本離心收集菌體沉淀；含DNA酶樣本需用專用試劑盒進(jìn)行DNA提取，避免降解；固體樣本需裂解細(xì)胞釋放核酸。  

核酸提取與質(zhì)控  

使用磁珠法或柱提法試劑盒提取DNA，通過分光光度計(jì)檢測(cè)濃度（≥50ng/μL）與純度（A260/A280≈1.8）。  

反應(yīng)體系構(gòu)建  

試劑配制：10μL體系含PCR緩沖液、dNTPs、特異性引物（Tm值50-60℃）、Taq酶、模板DNA及無菌水。  

對(duì)照設(shè)置：陽(yáng)性對(duì)照（已知支原體DNA）、陰性對(duì)照（無支原體樣本）、空白對(duì)照（無模板）。  

qPCR擴(kuò)增與監(jiān)測(cè)  

程序設(shè)定：預(yù)變性95℃/3min，循環(huán)40次（變性95℃/15s→退火55℃/20s→延伸72℃/40s），末段延伸72℃/5min。  

熒光通道：FAM檢測(cè)支原體信號(hào)，HEX檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照信號(hào)，避免假陰性。  

數(shù)據(jù)分析與報(bào)告  

系統(tǒng)自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線，結(jié)合陽(yáng)性/陰性對(duì)照判定結(jié)果。報(bào)告包含樣本Ct值、擴(kuò)增曲線圖、實(shí)驗(yàn)參數(shù)（儀器型號(hào)、試劑批號(hào)）及結(jié)論，支持電子/紙質(zhì)版交付。  

三、支原體qpcr法檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)  

優(yōu)勢(shì)：靈敏度達(dá)10²copies/mL，特異性強(qiáng)（避免交叉反應(yīng)），2-3小時(shí)快速出結(jié)果，支持批量檢測(cè)與定量分析。  

注意事項(xiàng)：防止污染（使用無菌操作臺(tái)、分裝試劑）、避免假陽(yáng)性（滅活樣本需結(jié)合培養(yǎng)法驗(yàn)證）、確保樣本穩(wěn)定性（避免反復(fù)凍融）。